可变剪接分析详解 / Alternative Splicing

Sun, 21 Feb 2021 00:00:00 +0000

背景

在真核生物中，一个基因可以通过可变剪接（Alternative Splicing, AS）产生多种 mRNA 亚型（isoform）——即在 pre-mRNA 剪接过程中，通过不同的外显子组合方式，生成不同的成熟 mRNA。这一机制在不增加基因数目的前提下，极大扩展了蛋白质组（proteome）的多样性。

一个含有 N 个外显子的基因，理论上最多可产生 2^(N-1) 种剪接变体。实际中，大多数基因产生 2-10 种亚型，但个别基因（如果蝇 Dscam）可产生数万种剪接变体（splice variant）。

为什么需要计算分析

高通量转录组测序（RNA-seq、全长 cDNA 测序）会产生数千条转录本比对到参考基因组上的结果。人工逐个检查每个基因的剪接变异是不现实的。计算流程需要：

将属于同一基因位点的转录本聚类
区分真正的剪接变体与比对假象（alignment artifact）
对每种剪接变异进行分类
对全基因组的 AS 事件进行定量和汇总

AS Code 的概念

AS Code 体系（Sammeth et al., 2008）提供了一种紧凑、无歧义的记号来描述任意可变剪接事件。其核心思想是：

对于任意一对重叠的转录本，它们之间不同的剪接位点定义了 AS 事件。将这些差异位点按位置编号，并标记为供体（^）或受体（-），即可得到唯一描述该事件结构的编码。

这一编码使得 AS 事件可以被系统地分类为具有生物学意义的类别。

输入数据与预处理

所需输入文件

文件	格式	内容
基因组	FASTA	参考基因组序列
基因注释	GTF	基因模型及外显子坐标
cDNA 比对	GFF3 (cDNA_match)	全长 cDNA 比对结果

基因注释提供参考转录本结构；cDNA 比对提供实验观测到的转录本结构，可能揭示注释中未收录的新剪接变体。

海水与淡水环境下日本鳗鲡多组织差异表达基因分析

Thu, 15 Aug 2019 00:00:00 +0000

摘要

本研究对海水（SEA）与淡水（TAP）环境下鳗鲡的三个关键组织（脑部、性腺、胸鳍）进行了差异表达基因（DEG）分析，旨在揭示鳗鲡在盐度适应过程中的转录组响应机制。

主要发现：

全局分析（控制组织效应）鉴定出 422 个 DEG（303 上调，119 下调）
脑部对盐度变化最为敏感，共鉴定出 500 个 DEG
三组织共同显著（交集）的核心响应基因共 8 个，全部在海水环境中上调表达

主要结论：

日本鳗鲡对盐度变化具有组织特异性的转录组响应，其中脑部响应最强，胸鳍最保守。
海水环境激活了更多基因（全局分析：72% 上调），表明海水盐度环境促进了特定的基因表达程序。
不同组织的响应模式差异反映了组织特异性功能对环境盐度的差异化适应策略。

一、材料与方法

1.1 样本信息

实验选用的是2017年5月31日在泉州地区购买的非野生养殖鳗。购买时，挑选体重300g - 1000g，体型较鼓，胸鳍圆钝、颜色深，背黑腹银的鳗鲡。此为下海前雌性银鳗的典型特征，形态学上雌雄鉴别的准确率约为90%¹。

从5条非野生鳗中随机挑选3条进行盐度驯化，与淡水养殖的鳗鲡形成对照。每日定时添加6.6‰海水盐，到第五天，实验组鳗鲡所处环境达到30‰左右的盐浓度（海水盐度约为35‰），模拟日本鳗鲡洄游入海的盐度变化过程。

取样时，将全部5条日本鳗鲡经冰水处理达到麻痹的效果，之后可进行形态指标的测量及解剖。每条日本鳗鲡各取脑部、性腺及胸鳍作为RNA测序样本，为避免RNA水解，取下后立即投入液态氮中冷冻保护。

样本	体长（mm）	体重（g）	水平眼径（mm）	垂直眼径（mm）	眼间距（mm）	吻长（mm）	胸鳍长（mm）	胸鳍宽（mm）	肛门到腹鳍起始端（mm）
SEA_1	695	553	12	11	15	12	35	16	5
SEA_2	650	570	10	9	13	13	30	20	4
SEA_3	680	600	11	11	13	13	30	16	4
TAP_1	675	610	/	/	/	/	30	20	8
TAP_2	715	650	9	10	15	16	27	18	5

注：

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