選択的スプライシング解析詳解 / Alternative Splicing

Sun, 21 Feb 2021 00:00:00 +0000

背景

真核生物において、一つの遺伝子は選択的スプライシング（Alternative Splicing, AS）によって複数の mRNA アイソフォーム（isoform）を産生しうる。すなわち、pre-mRNA のスプライシング過程で異なるエクソンの組み合わせをとることで、異なる成熟 mRNA が生成されるのである。この仕組みは、遺伝子数を増やすことなくプロテオーム（proteome）の多様性を飛躍的に拡大する。

N 個のエクソンを持つ遺伝子は、理論上最大 2^(N-1) 種のスプライスバリアントを産生しうる。実際には多くの遺伝子が 2〜10 種のアイソフォームを産生するが、ショウジョウバエの Dscam のように数万種のスプライスバリアント（splice variant）を産生する例外的な遺伝子も存在する。

計算解析が必要な理由

ハイスループットトランスクリプトームシーケンシング（RNA-seq、全長 cDNA シーケンシング）は、参照ゲノムにマッピングされた数千本の転写産物を生み出す。これらを人手で一つひとつ検査することは現実的ではない。計算パイプラインに求められるのは以下の処理である。

同一遺伝子座に属する転写産物のクラスタリング
真のスプライスバリアントとアライメントアーティファクト（alignment artifact）の識別
各スプライスバリアントの分類
全ゲノム規模での AS イベントの定量と集計

AS Code の概念

AS Code 体系（Sammeth et al., 2008）は、任意の選択的スプライシングイベントをコンパクトかつ曖昧さなく記述する記法を提供する。その中核となる考え方は次のとおりである。

重複する任意の転写産物ペアについて、両者間で異なるスプライス部位が AS イベントを定義する。これらの差異部位を位置順に番号付けし、ドナー（^）またはアクセプター（-）として標識すれば、当該イベントの構造を一意に記述するコードが得られる。

このコード化により、AS イベントを生物学的に意味のあるカテゴリへ体系的に分類できるようになる。

入力データと前処理

必要な入力ファイル

ファイル	形式	内容
ゲノム	FASTA	参照ゲノム配列
遺伝子アノテーション	GTF	遺伝子モデルおよびエクソン座標
cDNA アライメント	GFF3 (cDNA_match)	全長 cDNA アライメント結果

遺伝子アノテーションは参照転写産物の構造を提供し、cDNA アライメントは実験的に観測された転写産物構造を提供する。後者には、アノテーションに未収録の新規スプライスバリアントが含まれている可能性がある。

海水と淡水域におけるニホンウナギの多組織差次的発現遺伝子解析

Thu, 15 Aug 2019 00:00:00 +0000

要旨

本研究は、海水（SEA）と淡水（TAP）の環境下で飼育したニホンウナギの三つの重要組織（脳、生殖腺、胸鰭）について差次的発現遺伝子（DEG）解析を行い、塩分適応過程におけるトランスクリプトーム応答機構の解明を目的とする。

主な知見：

包括的分析（組織効果の制御）により422個のDEG（発現上昇303、発現低下119）を同定した
脳は塩分変化に最も敏感で、計500個のDEGが検出された
三組織すべてで共通して有意な応答を示した中核的遺伝子は8個であり、いずれも海水環境下で発現上昇していた

主な結論：

ニホンウナギは塩分変化に対して組織特異的なトランスクリプトーム応答を示し、脳の応答が最も強く、胸鰭が最も保守的であった。
海水環境はより多くの遺伝子を活性化し（包括的分析：72％が発現上昇）、海水の塩分環境が特定の遺伝子発現プログラムを促進することを示唆する。
組織ごとの応答パターンの差異は、組織特異的な機能が環境塩分に対してそれぞれ異なる適応戦略をとることを反映している。

一、材料と方法

1.1 試料情報

実験には、2017年5月31日に泉州地域で購入した非野生の養殖ウナギを用いた。購入時に、体重300g〜1000gで、体形がふっくらとし、胸鰭が丸みを帯びて色が濃く、背部が黒色で腹部が銀白色の個体を選別した。これらは降海前の雌の銀ウナギの典型的な特徴であり、形態学的な雌雄判別の正確度は約90％である¹。

5尾の非野生ウナギからランダムに3尾を選び塩分馴致を行い、淡水飼育のウナギと対照群を形成した。毎日定時に6.6‰の海水塩を添加し、5日目には実験群のウナギの環境塩分濃度が約30‰（海水の塩分は約35‰）に達し、ニホンウナギの降海回遊時の塩分変化過程を模擬した。

サンプリングに際しては、全5尾のニホンウナギを氷水処理により麻痺させた後、形態指標の測定および解剖を行った。各ニホンウナギから脳、生殖腺および胸鰭をRNAシーケンシング用試料として採取し、RNAの加水分解を防ぐため、採取後直ちに液体窒素中で凍結保存した。

試料	体長（mm）	体重（g）	水平眼径（mm）	垂直眼径（mm）	眼間隔（mm）	吻長（mm）	胸鰭長（mm）	胸鰭幅（mm）	肛門-腹鰭起始端間（mm）
SEA_1	695	553	12	11	15	12	35	16	5
SEA_2	650	570	10	9	13	13	30	20	4
SEA_3	680	600	11	11	13	13	30	16	4
TAP_1	675	610	/	/	/	/	30	20	8
TAP_2	715	650	9	10	15	16	27	18	5

注：

Rna-Seq on TouchingFish.top